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基于酿酒酵母工业系统代谢工程的L-鸟氨酸生物合成-手机知网

发布时间:2019-07-04 01:25 来源:未知 编辑:admin

  以构建“微生物细胞工厂”为目标的微生物代谢工程为人类衣、食、住、行、医提供越来越多的包括以氨基酸为合成起点的氨基酸衍生物在内的生物基药品、健康营养品、新型生物基材料。虽然经过选育的大肠杆菌(Escherichia coli)与谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)有着极强的氨基酸合成能力,但是对复杂发酵环境以及特殊化合物毒性的鲁棒性、对包括P450还原酶在内的特殊酶系表达的匹配性,使得遗传操作成熟、生物元件丰富的单细胞真核生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)成为相关氨基酸类衍生物的更合适开发平台。但是,由于酿酒酵母相对于原核生物更严格的氨基酸调控机制,基于酵母平台的相关以氨基酸为代谢合成起点的化合物发酵产量、碳源产物转化率以及生产强度还有很多可提升空间。为此,系统改造酿酒酵母内源氨基酸代谢,过量合成相关氨基酸前体,是低价从头合成相关氨基酸基化合物的重要前提。本论文,以酿酒酵母精氨酸与鸟氨酸代谢为研究案例,以模块化途径重构为主要技术平台,对包括碳源转运、基础碳代谢、基础氨代谢、呼吸链、鸟氨酸乙酰基衍生物循环、胞内亚细胞器转运在内的内源代谢进行系统设计改造,过量合成重要营养化学品、精氨酸合成重要中间代谢物L-鸟氨酸。这也是首例系统改造真核生物过量合成氨基酸与氨基酸代谢物的案例,为低价从头合成其他高附加值相关化合物提供研究基础。本论文主要研究结果如下:(1)替换鸟氨酸氨甲酰基转移酶编码基因ARG3的内源性启动子为弱表达性HXT1启动子或KEX2启动子,实现了鸟氨酸的胞外分泌,并导致胞内精氨酸浓度下降。当过表达氨基酸代谢全局调控因子Gcn4p编码基因,鸟氨酸积累并没有得到进一步提高,共过表达鸟氨酸乙酰基循环途径相关编码基因ARG2、ARG5,6、ARG7以及ARG8,鸟氨酸产量显著提升。但是值得注意的是,当单独过表达ARG2、ARG5,6、ARG7以及ARG8,鸟氨酸产量并没有实质性提高。鸟氨酸氨基转移酶编码基因CAR2的敲除并没有使鸟氨酸产量显著变化。(2)为消除代谢区隔效应对于鸟氨酸合成以及过量积累的影响,过量表达鸟氨酸、谷氨酸以及α-酮戊二酸线粒体转运蛋白相关编码基因。研究显示,当过表达鸟氨酸转运蛋白合成基因ORT1以及谷氨酸转运蛋白编码基因AGC1鸟氨酸产量得到显著提升,过表达α-酮戊二酸转运蛋白编码基因ODC1鸟氨酸产量并没有实质性提高。为提高鸟氨酸前体谷氨酸的供给,探究不同谷氨酸合成路径对于谷氨酸合成以及鸟氨酸积累的影响,三条酿酒酵母内源性谷氨酸合成途径皆得到过表达。研究结果显示,当系统一(GDH1所编码的依赖于NADPH的谷氨酸脱氢酶)、系统二(GDH3所编码的依赖于NADPH的谷氨酸脱氢酶)以及系统三(GLT1编码的依赖于NADH谷氨酸合酶-GLN1编码的谷氨酰胺合酶)的过表达,鸟氨酸合成皆得到强化,其中依赖于NADPH的谷氨酸脱氢酶编码基因GDH1的过表达效果最显著。(3)为进一步降低由于鸟氨酸合成途径与其前体谷氨酸合成代谢区隔而引起的代谢流损耗,代谢途径亚细胞结构重定位策略得到应用。当构建来自于大肠杆菌以及谷氨酸棒状杆菌的基于细胞质的嵌合鸟氨酸合成途径实质性提高鸟氨酸合成,然而,当定位谷氨酸合成酶基因MLS-GDH1以及MLS-GDH2于线粒体,鸟氨酸产量以及细胞生物量显著下降。(4)为降低葡萄糖效应以提高TCA循环代谢流以及谷氨酸前体α-酮戊二酸的供给,过量表达TCA循环氧化部分相关合成基因、去除磷酸化调控位点的丙酮酸脱氢酶亚基以及丙酮酸羧化酶,探究对于葡萄糖效应以及鸟氨酸合成的影响。共表达丙酮酸脱氢酶E1α亚基编码基因PDA1、丙酮酸羧化酶合成基因PYC2、柠檬酸合酶编码基因CIT1,顺乌头酸酶编码基因ACO2以及异柠檬酸脱氢酶编码基因IDP1,显著提高鸟氨酸的产量。乙醇合成速率以及葡萄糖消耗速率的变化进一步显示,相关基因的过表达并没有带来葡萄糖效应的实质性下降。前人研究显示,丙酮酸脱氢酶E1α亚基编码基因PDA1的突变体PDA1[S313A]由于磷酸化位点被解除,能够降低葡萄糖效应。本研究中,当共过表达PDA1[S313A]、PYC2、CIT1,ACO2以及IDP1,鸟氨酸产量并没有得到显著提升。(5)为降低葡萄糖效应以提高TCA循环代谢流以及谷氨酸前体α-酮戊二酸的供给,过量表达替代性NADH氧化酶相关编码基因,鸟氨酸产量显著提升。乙醇产生速率下降以及乙醇葡萄糖得率提高表明,葡萄糖效应得到实质性下降。为进一步降低葡萄糖效应,通过过表达葡萄糖转运信号转导路径中重要调控因子Mth1p,考察该靶点对于葡萄糖转运、葡萄糖效应以及鸟氨酸合成的影响。当过表达解除泛素降解调控位点的Mth1p合成基因MTH1-?T,葡萄糖效应解除,鸟氨酸产量以及对于葡萄糖的得率显著提升。但是,菌株最大比生长速率显著下降。为下调α-酮戊二酸脱氢酶复合体的活性,探究其对于鸟氨酸合成的影响,当基于启动子替换策略替换α-酮戊二酸脱氢酶复合体重要组分二氢硫辛酸琥珀酰基转移编码基因KGD2的启动子为弱启动子KEX2启动子,鸟氨酸产量显著下降,然而,菌株生长亦明显降低。(6)为进一步降低胞内精氨酸积累,通过过表达精氨酸酶对尿素循环进行调控,探究其对于鸟氨酸合成的影响。研究结果显示,精氨酸酶编码基因CAR1的过表达显著提高鸟氨酸产量。

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